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デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析

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デジタルPCRの受託解析サービスについてはこちら

デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析リーフレットのダウンロードはこちら をご利用ください。

 

■デジタルPCRとは

デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べてはるかに高精度、高感度に定量を行う新しい技術です。定性のみの通常PCR、検量線による相対定量のリアルタイムPCRに対して、絶対定量を行うデジタルPCRは第3世代のPCRと言われています。

デジタルPCRはリアルタイムPCRと全くコンセプトが異なり、限界希釈(各微小区画にターゲットDNAが1または0となるような希釈)したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCR増幅を行います。これによってターゲット遺伝子を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり、ターゲット遺伝子を含まないもしくはサンプルDNA自体を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなります。ポジティブの微小区画の数を直接カウントすることでサンプル中のターゲット遺伝子濃度を絶対的に測定します。

限界希釈したサンプルDNAであっても微小区画あたりの断片数が1以上になる場合があります。これを補正するため、ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出します。ポアソン分布での補正はソフトウェアにより自動的に算出されます。

ジェネティックラボではドロップレットを自動調製するDroplet Generatorを導入しているため、多検体を再現性良く測定することが可能です。

ddpcr-prod-nav-systems

 

■Droplet Generatorの仕様

機器名
QX200 Droplet Digital PCRシステム
販売会社
バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社
サンプル容量(μL)
20
QX200 Droplet Generator
1ランあたりのサンプル処理数
1 ~ 96 サンプル
サンプル20μLあたりの
ドロップレット数
最大20,000
励起光源
2LED
検出器
MPPC (Multipixel Photon Counters)
検出チャネル
FAM (EvaGreen)、HEX (VIC)
ダイナミックレンジ
5オーダー
精度
±10%
読み取り区画数
10,000以上/サンプル
QX200 Droplet Generator サイズ
(W x D x H)
28 x 36 x 13 cm (11 x 14 x 5")
QX200 Droplet Reader サイズ
(W x D x H)
66 x 52 x 29 cm (26 x 20 x 11")
QX200 droplet reader capacity
1-96 samples

 

■ddPCRの特長

絶対定量
  • 1mLあたりのコピー数
  • 検量線不要
  • エンドポイント測定なので、増幅効率に影響されにくい
高精度
  • 1.1倍希釈系列を判別可能
  • qPCRでは困難な低濃度域での精度が高い
高感度
  • バックグラウンドの影響を減少させて、微量なターゲットを増幅
  • 0.001%オーダーで検出
高処理性
  • 1回のランで96サンプルの測定が可能
  • 低ランニングコスト

 

■デジタルPCRのアプリケーション

  • CNV(Copy Number Variation)
  • Rare mutation / Rare sequence 検出
  • mRNA、 miRNA 定量(高精度定量、低コピー数定量)
  • Single cell など、微量サンプルでの定量

 

■ワークフロー

qx200-system-workflow-thumb-qx200-droplet-digital-pcr-system

1. ドロップレットの作成

  • 専用カートリッジに調製したサンプルおよび専用オイルを分注します。
  • カートリッジをセットした後、サンプルを微小区画に分割します。
  • ターゲットDNAとバックグラウンドDNAがランダムに分散します。

2. PCR

  • 専用カートリッジの各ウェルで作成したドロップレットを、96ウェルのPCRプレートの各ウェルに移し、シーリングを行います。
  • その後、それぞれの微小区画で個別にPCR反応を行います。

3. ドロップレット蛍光測定およびデータ解析

  • PCR終了後、96ウェルPCRプレートをQX200 Droplet Readerにセットします。
  • 各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し、ポジティブな微小区画の数およびネガティブな微小区画の数を直接カウントします。
  • QuantaSoftソフトウェアを使用し、ポジティブな微小区画の割合からターゲットの濃度(コピー/μL)を算出します。

【バイオ・ラッド社の製品紹介ページ】http://www.bio-rad.com/ja-jp/category/digital-pcr
https://ls.ipros.jp/advertising/detail/33462/

※セルフリーDNAの解析は、解析用に専用採血管を準備し、全血より血漿の回収から受託いたします。凍結した血清、血漿からの受託も可能です。

 

■使用プローブ

  • リキッドバイオプシーに対応して開発されたプローブが使用可能です。
  • QX200システムに対して開発されたプローブのため、全てワーク確認済みです。
  • Singleplex用のプローブを用いたtypingだけでなく、Multiplex用のプローブを用いたtyping、ホットスポットに対するプローブを用いたScreeningが可能です。
  • 対象がん種に対して薬剤感受性または耐性変異の検出が可能です。変異のモニタリングに最適です。

【変異解析用プローブ】

対象組織 遺伝子 対象変異 検出
Lung ALK p. E17K single
p. T1151_L1152insT single
p. L1152R single
p. C1156Y single
p. I1171T single
p. F1174L single
p. V1180L single
p. L1196M single
p. G1202R single
p. S1206Y single
p. G1269A single
p. L1198F single
p. T1151_L1152insT,
p. C1156Y, p. L1196M,
p. G1269A
multi
p. L1152R, p. F1174L,
p. V1180L
multi
p. I1171T, p. G1202R,
p. S1206Y
multi
EGFR p. L858R single
p. T790M single
p. C797S (c.2389T>A,
c.2390G>C)
multi
p. G719C/A/S multi
Exon19 Deletion screening
PIK3CA p. E542V/K,
p. E545V/G/A/Q/K,
p. Q546L/R/P/E/K
screening
p. H1047L/R/Y,
p. G1049R/S
screening
ROS1 p. G2032R single
Brest ESR1 p. Y537N single
p. Y537S single
p. D538G single
p. E380Q single
p. Y537N/S, p. D538G multi
p. V534E, p. P535H,
p. L536R/Q/P/H,
p. Y537N/C/S, p. D538G
screening
ESR1/YAP1 fusion expression
PIK3CA p. E542V/K,
p. E545V/G/A/Q/K,
p. Q546L/R/P/E/K
screening
p. H1047L/R/Y,
p. G1049R/S
screening
Melanoma BRAF p D549G/N, p. K601E,
p. V600E/K/R/G/M/D
screening
NRAS p. Q61R/K/L?H/P/E,
p. E62K
screening
MEK1 p. C121S, p. P142S/L,
p. G128V/D, p. F129L
screening
Other AR AR v7 expression
EGFR p. S492R (c. 1474A>C) single
EGFR p. S492R (c. 1476C>A) single
SMO p. D473H single

【CNV解析用プローブ】

対象遺伝子 reference
AKT1 CTNNB1 IGF2R AP3B1
AKT2 EGFR KIT APOB
ALK ESR1 KRAS AQP5
AR FGFR1 MEK PMP22
BRAF FGFR2 NRAS RPP30
CCND1 FGFR3 PDGFRA TOP3A
CDK4 HER2 PIK3CA -
CDK6 IGF1R VEGFR
cMET -

 

※表にないターゲットについても対応可能な場合がございますので、ご検討内容をお問い合わせください。

 

■リーフレットのダウンロード

デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析リーフレットのダウンロードはこちら をご利用ください。

 

 

なお、本件に関するお問い合わせは、お問い合わせフォームよりお願いいたします。